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　　實(shí)驗(yàn)方法原理:

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

　　儀器、耗材:

　　離心管

　　離心機(jī)

　　風(fēng)光光度計(jì)

　　電泳槽

　　凝膠板

　　Realtime PCR儀

　　實(shí)驗(yàn)步驟:

　　一、 樣品RNA的抽提

　　1. 取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。

　　二、 RNA質(zhì)量檢測(cè)

　　1. 紫外吸收法測(cè)定

　　先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。

　　(1)濃度測(cè)定

　　A260下讀值為1表示40 ug RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計(jì)算公式為：A260 x 稀釋倍數(shù) x 40 ug/ml。具體計(jì)算如下：

　　RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀釋至495 ul的TE中，測(cè)得A260 = 0.21

　　RNA 濃度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul

　　取5 ul用來測(cè)量以后，剩余樣品RNA為35 ul，剩余RNA總量為：

　　35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug

　　(2)純度檢測(cè)

　　RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

　　2. 變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定

　　(1)制膠

　　三、樣品cDNA合成

　　四、 梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的管家基因(β-actin)實(shí)時(shí)定量PCR

　　五、 制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板

　　六、 待測(cè)樣品的待測(cè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR

　　1. 所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系。

　　2. 體系配置如下：

　　序號(hào) 反應(yīng)物 劑量

　　1 SYBR Green 1 染料 10 ul

　　2 上游引物 1 ul

　　3 下游引物 1 ul

　　4 dNTP 1 ul

　　5 Taq聚合酶 2 ul

　　6 待測(cè)樣品cDNA 5 ul

　　7 ddH2O 30 ul

　　8 總體積 50 ul

　　輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。

　　(3)將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93℃ 2分鐘預(yù)變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個(gè)循環(huán)，后72℃7分鐘延伸。

　　七、 實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表

　　引物設(shè)計(jì)軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補(bǔ);引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu);引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。

　　八、電泳

       各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。